益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究-宜昌西陵国爱诊所

②通过急性毒理实验，观察7天内小鼠的外观、饮食、活动、排泄、死亡等情况；

③临床观察病人260例。

结果：

①与模型对照组大鼠比，益舒软肝丸组组织切片显示汇管区有少量纤维组织增生，但未见假小叶结构；肝功能指标ALT、AST减少，A/G、CHE增加，肝功能有显著好转；HA、LN、PC-Ⅲ、Hyp水平显著降低，肝纤维化程度降低；MDA水平降低；TGF-β1和TIMP-1阳性表达减少。因此益舒软肝丸具有明显的逆转肝硬化的作用：可明显降低胶原纤维增生程度，改善肝功能；能降低肝硬化模型大鼠MDA水平，减轻肝细胞损伤，逆转肝硬化病理形态结构；能下调肝硬化模型大鼠组织TGF-β1和TIMP-1的表达，抑制细胞外基质的合成和胶原增生、沉积，达到治疗肝硬化的作用。

② 给药后7天内无一小鼠死亡，其皮毛光滑、饮食、活动、排泄等未出现异常，处死小鼠后经大体解剖检查，主要脏器无任何不良病变。计算出其最大耐受量为生药53.3g/kg，给药量相当于人临床用量的333倍。

③ 临床观察显效163例，占62.7%；总有效率95.4%。且能使肝脾外形恢复正常。

结论：益舒软肝丸有明显的逆转肝硬化的作用，无明显的毒性作用，对肝硬化病人有良好的治疗作用。

关键词：益舒软肝丸肝硬化逆转中医药疗法实验研究

引言

各种病因引起肝细胞弥漫性炎性坏死、再生、诱发肝脏广泛的纤维结缔组织增生、小叶结构破坏、假小叶形成，纤维间隔包绕再生的肝细胞而形成大、小结节，隧成为肝硬化。临床上有多系统受累，以肝功能损害和门静脉高压为主要表现。肝硬化是临床常见的慢性进行性肝病，是一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害。“肝炎-肝纤维化-肝硬化”组成的“三步曲”是多种慢性肝病导致严重后果的共同途径。肝硬化分布遍及全世界，在我国也是常见病和主要死亡病因之一，占内科总住院人数的4.3%-14.2%。仅在我国3000万慢性乙肝患者中就有0.4%～14.2%演变为肝硬化。

目前西医治疗肝硬化尚无特效疗法，一般是病因治疗、支持疗法、抗纤维化治疗、肝移植。而中药却在治疗上表现出独特的优势，中药复方是中医治疗疾病的重要特点之一，多靶点、多途径、多层次药理作用是复方中药抗肝硬化的特色。近年研究发现我国的许多中草药具有良好的抗肝硬化疗效，以复方861合剂、小柴胡汤等为代表，引起国内外肝病研究者的广泛兴趣，中药抗肝硬化研究具有广阔的发展前景。

益舒软肝丸为民间验方，由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、别甲、桃仁等中药组成，在长期临床实践中显示益舒软肝丸治疗肝硬化作用明显，临床疗效高，未见明显毒副作用。部分病人治疗前肝功能指标异常、肝脾形态及大小异常、门静脉增粗，治疗后肝脾大小、回声及肝功能指标完全恢复正常，有使肝硬化逆转的表现，对目前肝硬化治疗无法达到逆转而言是一个突破，值得进一步研究开发。

肝硬化属中医的癥瘕、积聚、臌胀等范畴。由于慢性肝炎、血吸虫病等肝病失治、误治或治疗不彻底湿热毒邪未清除,肝失疏泄、脾失运化、水湿内停蓄积于腹中,肝郁气滞、气滞则血瘀,瘀阻脉络日久则成积聚。另一方面,湿邪易伤阳耗气，热邪灼阴血耗津液，湿热久蕴则伤阴血耗阳气，日久导致肝脾肾亏虚，气血两虚，气虚则血瘀,气血运行不畅则津液不能疏布，水湿蓄于腹中成臌胀。或者饮食不节、嗜酒过度,或情志内伤、劳欲过度,导致肝、脾、肾功能受损,气滞、血瘀、水湿内停而成臌胀。中医认为肝硬化的基本病机是正衰邪盛，湿热未尽兼血瘀，肝郁脾肾气血虚。肝郁气滞，导致血瘀,经隧阻塞，血不养肝,关键在于血瘀。血瘀表现在肝硬化的病理上就是肝纤维化的形成。因此,益舒软肝丸以活血化瘀,补气养血，健脾补肾为治疗原则。方中水蛭、虻虫、蛴螬可破血逐瘀、通经软坚，配桃仁，可化瘀通经，去瘀生新，加冬虫夏草补肺肾、益精气。现代药理研究已证实，以上诸药具有程度不等的抗肝纤维化作用。

因此本课题将探讨益舒软肝丸治疗肝硬化大鼠的疗效和逆转肝硬化的可能机制。

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

1 益舒软肝丸对实验性大鼠肝硬化的治疗研究

1.1 实验材料

1.1.1实验动物：

Wistar雄性大鼠，清洁级，体重100±20g，共80只。购自华中科技大学同济医学院(动物许可证号Scxk(鄂)2004-0007)。动物予以标准饲料喂养(购自华中科技大学同济医学院动物中心)，自由摄食饮水，12 h明/12 h暗(光照时间6:00-18:00)，22-30℃条件下饲养1周后实验。

1.1.2 药品与主要试剂

益舒软肝丸(Yishuruanganwan,YS)由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、鳖甲、桃仁等中药组成，粉成粉末过120目筛，由宜昌县人民医院药剂科制备。用双蒸水配成高(1.6g/kg体重)、中(0.8g/kg体重)、低(0.4g/kg体重)三个剂量组混悬液。

金龙鱼大豆油由南海油脂工业有限公司生产。

分析纯四氯化碳，上海试剂总厂生产，批号：20040515 。

胆固醇，北京鼎国生物技术有限责任公司生产。

丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及羟脯氨酸(Hyp)试剂盒,南京建成生物工程研究所

血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)和 Ⅲ型前胶原(PC-Ⅲ)放射免疫分析试剂盒，北京北方生物技术研究所

冰醋酸，武汉江北化学试剂有限责任公司，批号：20020829。

兔抗鼠TIMP-1多克隆抗体武汉博士德生物工程有限公司

即用型SABC免疫组化试剂盒武汉博士德生物工程有限公司

兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体美国SANTA CRUZ

二步法免疫组化检测试剂北京中杉金桥生物技术有限公司

浓缩型DAB试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司

1.1.3 主要仪器

MA200型电子分析天平，上海第二天平仪器厂。

UV-2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯仪器有限公司。

80-2型电动离心机，江苏恒丰仪器厂。

-80℃低温冰箱，美国LANIS公司生产

DK-S26型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。

WH-1型微型旋涡混匀器，上海泸西分析仪器厂

ULTRACUT-R型超薄切片机，德国Leica公司生产。

EG1150型石蜡包埋机，德国Leica公司生产。

DM-R型多功能显微镜及测量系统，德国Leica公司生产。

Q500型图像分析仪，德国Leica公司生产

电子PH计，产自METTLER TOLEDO DELTA 320型

放免测量仪器，上海核辐光电仪器有限公司的 SN-695型智能放射免疫γ计数器。

1.2 实验方法

1.2.1试剂配置

1.2.1.1给药剂量

YS成人临床常用剂量为8g生药/ d；根据人和动物体表面积与剂量换算，YS低剂量：生药0.4g /kg/d；YS中剂量：生药0.8g /kg/d;YS高剂量：生药1.6g /kg/d;分别相当于临床用量的0.5倍，1倍，2倍。各给药组均每日定时给药一次。每周称动物体重一次，按体重调整给药量。

1.2.1.2 40%CCL4：

金龙鱼大豆油经高温消毒后备用。将分析纯四氯化碳与金龙鱼大豆油按体积比2：3混合。配成40%CCL4，闭光密闭保存。

1.2.1.3 VG(Van Gieson)染液：

1%酸性品红水溶液(酸性品红0.1克，蒸馏水10ml)10ml与苦味酸饱和水溶液90ml充分混合。

1.2.2实验动物分组及模型制备

动物常规适应性饲养1周后开始实验，随机分为正常对照组(8只)和模型组。采用复合因素造模法，模型组动物背部皮下注射40%CCL4油剂，首剂0.5ml/100g，以后每次0.3ml/100g，2次/周。同时采用高脂低蛋白食物：前2周，20%猪油+0.5%胆固醇+79.5%玉米面;后四周，0.5%胆固醇+99.5%玉米面。自由饮水。6周末随机取2只检测造模是否成功。造模成功后(见图1)，改食普通饲料。模型组大鼠又随机分为模型对照组(n=12只)、YS 0.4g/kg组(n=10只)、0.8g/kg组(n=9只)、1.6g/kg组(n=9只)。模型对照组给予生理盐水(1ml/只)灌服，治疗组给予YS的混悬液灌胃，每天1次，连续灌胃12周，并持续背部皮下注射CCL40.3ml/100g/次/周。12周末处死动物，留取血和肝组织标本。取左中叶相同部位，10%福尔马林溶液固定，制作病理石蜡切片。

1.2.3标本的采集与处理：

禁食12小时后，腹腔注射 3%戊巴比妥钠，40mg/kg。动物麻醉后开胸心脏采血，分离血清，-20℃保存。再取左中叶相同部位，10%福尔马林溶液固定，制作病理石蜡切片，分别作HE和VG染色和免疫组化。余下肝脏置于塑料薄膜袋，迅速封口置于-80℃冰箱用于肝组织匀浆检测。

1.2.4观察项目及检测方法

1.2.4.1动物一般情况

观察动物的饮食、活动、毛色、死亡等情况。于实验末称动物体重及全肝、脾脏湿重，计算肝脏脏器系数：肝脏/体重x100；脾脏脏器系数：脾脏/体重x100。

1.2.4.2血清学检测

取部分血清用自动生化分析仪检测肝功能相关指标丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、白蛋白(A)、球蛋白(G)、A/G 比值、胆碱酯酶(CHE)、碱性磷酸酶(AKP)。

另取部分血清按放射免疫试剂盒方法检测血清透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)和 Ⅲ型前胶原(PⅢNP)。

1.2.4.3肝组织检测

取部分肝脏制成肝组织匀浆，测MDA、SOD及羟脯氨酸(Hyp)，按试剂盒说明操作。

1.2.4.4肝组织形态学检测

取肝左叶,10%福尔马林固定,石蜡包埋,5um连续切片,分别用于HE染色、VG染色,观察组织学变化, 根据纤维结缔组织增生程度将其分为0～4级。0级：正常肝脏，未见纤维化; Ⅰ级：包括汇管区、汇管区周围纤维化和局限窦周纤维化或小叶内纤维瘢痕，小叶结构完整; Ⅱ级：见纤维间隔即桥接纤维化，虽有纤维间隔，但小叶结构大部分保留; Ⅲ级：大量纤维间隔，分割并破坏肝小叶，致肝小叶结构紊乱，但尚无肝硬化; Ⅳ级；肝硬化，肝实质广泛破坏，弥漫性纤维增生，被分割的肝细胞团呈不同程度的再生及假小叶形成。

●HE 染色：

1).切片常规脱腊至水。

2).苏木精染色 1 分钟，自来水冲洗。

3).1%酒精盐酸分化30-60秒，自来水冲洗。

4).1%稀氨水反蓝30秒，自来水冲洗。

5).5%伊红酒精染色30-60秒，自来水洗去多余染料。

6).常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

●VG(Van Gieson)染色：

常规脱蜡至水：依次用二甲苯、无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、蒸馏水漂洗标本。用VG染液染1-5分钟后95%乙醇分化数秒，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光镜下观察大鼠肝脏胶原变化。胶原纤维呈红色，细胞核呈蓝黑色，肝细胞呈黄色。

1.2.4.5免疫组化

利用图像分析技术对免疫组化结果进行定量分析。光镜下观察肝组织标本免疫组化结果。每张切片在显微镜下400倍随机采集10个视野(避开边缘效应)，并要求每个观察视野包含一个汇管区或一个中央静脉,通过图文分析系统测定TGF-β1和TIMP-1免疫反应产物的阳性表达总面积和平均灰度值。免疫组化产物染色越深，灰度值越小，抗原物质的含量越高。

●TGF-β1免疫组化(SP法)以PBS代替一抗为阴性对照

1)石蜡切片脱蜡至水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，95酒精Ⅰ、Ⅱ，75酒精Ⅰ、Ⅱ各10分钟。

2)蒸馏水中稍漂洗一下。

3)放到PH6.0的枸橼酸缓冲液(枸橼酸5.4ml，枸橼酸钠24.6ml，加双蒸水至300ml)中，微波修复2次，每次温度升至90度，每次10分钟左右。拿出，静置。至缓冲液恢复至室温。

4)0.1M PBS洗3次，2分钟×3

5)檫干水，加30%的H2O2，30μl,10分钟。

6)0.1M PBS，3分钟×3

7)加正常血清(胎牛血清)30μl,10分钟。

8)甩干血清，加1：200的一抗。4℃过夜。

9)0.1M PBS，3分钟×3

10)擦干，加二抗30μl，37℃30分钟。

11)0.1M PBS，3分钟×3

12)擦干，DAB(0.9ml双蒸水中先加一滴A再加一滴B和一滴C)显色，开始镜下控制时间，后时间一致。

13)自来水充分冲洗，复染，封片。

●TIMP-1免疫组化(SABC法，)以PBS代替一抗为阴性对照

1)石蜡切片脱蜡至水。二甲苯Ⅰ、Ⅱ，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ，95酒精Ⅰ、Ⅱ，75酒精Ⅰ、Ⅱ各10分钟。

2)蒸馏水中漂洗。

4)0.1MPBS洗3次，2分钟×3

5)擦干水，加30%的H2O2，30μl,10分钟。

6)0.1M PBS，3分钟×3

7)滴加5%BSA封闭液，室温20分钟，甩去多余液体。

8)加1：50的兔抗鼠TIMP-1IgG一抗。4℃过夜。

9)0.1M PBS，3分钟×3次

10)擦干，加生物素化羊抗兔IgG25μl，37℃30分钟。

11)0.1M PBS，3分钟×3

12)擦干，滴加试剂SABC，37℃30分钟，0.1M PBS，3分钟×3

13)DAB显色，镜下控制时间，后时间一致。

14)苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。

1.2.5 统计处理

采用SPSS10.0统计软件处理。先进行数据的正态分布检验，方差齐性检验，组间比较采用方差分析。计量数据用均数±准差(X±S)表示，组间差异用单因素方差分析,多个样本均数间每两个均数的比较采用q检验。双侧P<0.05为检验水准。P<0.01为有显著差异。

1.3 结果

1.3.1一般情况

正常对照组大鼠无死亡，营养状况良好。模型对照组大鼠毛质粗糙,消瘦，精神萎靡，动作迟钝，易激惹，个别老鼠趾甲易出血，死亡4只;YS低剂量组死亡3只，YS中剂量组死亡2只，YS高剂量组死亡2只。

由表1.3.1和1.3.2可见各组间脾重和肝重差异无统计学意义，但用药组肝脏重量有所增加，脾脏重量有所减轻。模型对照组肝脏、脾脏脏器系数比正常组显著增加(P<0.01);用药各组与模型对照组比较肝脏、脾脏脏器系数明显降低(P<0.01，P<0.05)，YS中剂量组与正常组最接近。

表1.3.1 YS对肝硬化大鼠体重、脾脏和肝脏重量的影响(X±S)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

(YS低剂量模型组简称为0.4g/kg组，YS中剂量组简称为0.8g/kg组，YS高剂量模型组简称为1.6g/kg组。)

表1.3.2 YS对肝硬化大鼠体重、脾脏器系数和肝脏器系数的影响(X±S)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

(YS低剂量模型组简称为0.4g/kg组，YS中剂量组简称为0.8g/kg组，YS高剂量模型组简称为1.6g/kg组。)

1.3.2各组大鼠肝功能相关指标检测结果

模型对照组ALT、AST血清水平异常升高(P<0.01)， A/G明显降低(P<0.01), ALB、CHE降低(P<0.05)，与空白对照组比较差异有统计学意义。用药各组可明显降低血清ALT、AST水平，提高CHE，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。用药各组还可提高A/G、ALB降低AKP，但差异无统计学意义。见表1.3.2.1

各组大鼠血清肝纤维化指标检测结果，见表1.3.2.2

模型对照组HA、LN、PⅢNP明显升高，与正常组比较差异有显著性(P<0.01);用药各组可明显降低HA、LN、PⅢNP的水平，与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);其中YS 0.8g/kg组降低HA、LN、PⅢNP作用最明显。

表1.3.2.1 YS对肝硬化大鼠肝功能的影响(X±S)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

表1.3.2.2 YS对肝硬化大鼠HA、LN、PⅢNP及CⅣ含量的影响(X±S)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01；与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

1.3.3肝组织Hyp、MDA、SOD结果比较

由表可知，模型对照组Hyp、MDA含量最高，与正常组比差异有显著性(P<0.01);用药各组可明显降低Hyp、MDA含量，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05);用药组还可提高SOD水平，但与模型对照组比较差异无统计学意义。见表1.3.3

表1.3.3 益舒软肝丸对肝硬化大鼠Hyp、SOD和MDA的影响(X±S)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

1.3.4肝组织形态学观察结果

由图2可见：正常组大鼠肝小叶结构清晰完整，肝细胞条索状以肝小叶中央静脉为中心向周围呈放射状排列。VG染色未见纤维组织异常增生。模型对照组肝小叶结构破坏，肝细胞索排列紊乱，胶原纤维明显增生，呈较宽的条索状分割肝小叶，弥漫分布，形成假小叶。VG染色纤维组织大量异常增生，并向肝小叶内延伸形成粗大纤维间隔，大部分已包绕肝细胞团块，形成假小叶。YS 1.6g/kg组，肝小叶结构基本完整，有少量胶原纤维增生，未见假小叶结构。VG染色见少量纤维增生。YS 0.8g/kg组肝小叶结构基本完整，肝索排列相对整齐，胶原纤维增生较少，未见假小叶结构。VG染色汇管区和中央静脉周围可见少量纤维增生。YS 0.4g/kg剂量组肝小叶结构较紊乱，有较多胶原纤维增生。VG染色胶原纤维自中央静脉及汇管区向周围延伸，可见大量桥接纤维化，未见假小叶结构。

肝纤维化增生程度见表1.3.4

表1.3.4各组肝纤维化分级情况

1.3.5免疫组化结果

由图可见模型对照组TGF-β1的表达部位主要在汇管区周围细胞、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞、部分肝细胞以及纤维间隔内,呈棕黄色颗粒状,范围广;而正常对照组TGF-β1表达仅见于汇管区、肝窦内皮细胞、中央静脉周围细胞,且着色较浅、范围窄。用药各组阳性表达有所降低，多见于中央静脉周围细胞、窦壁细胞、窦周细胞、汇管区周围细胞。正常组TIMP-1有弱阳性表达，仅见个别间质细胞和肝细胞的胞浆内，模型对照组TIMP-1表达明显增强，集中于纤维沉积处、汇管区和肝窦。用药各组表达有所降低，多散在分布，与模型对照组相比有明显差异。

由表1.3.5可见从肝纤维化程度来看，随着肝纤维化的形成及加重，TGF-β1和TIMP-1的表达逐渐升高。YS治疗后不同程度减少。图像分析系统分析免疫组化染色结果显示，模型对照组TGF-β1和TIMP-1的阳性总面积明显增加，与正常组比较有显著差异(P<0.01);用各药后有不同程度减少，与模型对照组比差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)。TGF-β1和TIMP-1的平均灰度值NS组最低，用药后有不同程度的提高，但差异无统计学意义。

表1.3.5 益舒软肝丸对肝硬化大鼠免疫组化的影响(X±S)

注：与正常组比较△ P<0.05,△△ P<0.01;与模型对照组比较 * P<0.05,** P<0.01

(#由于配齐方差，TGF-β1阳性总面积为原始数据自然对数值)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

2 益舒软肝丸的毒理学研究

2.1 急性毒性实验

2.1.1材料

2.1.1.1实验动物：昆明种小白鼠26只，18～20g，雌雄各半，共26只。

2.1.1.2药物：YS由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、鳖甲、桃仁等中药组成，粉成粉末过120目筛，由宜昌县人民医院药剂科制备，未加任何辅料。

2.1.2方法

预实验：6只昆明小鼠。禁食10小时随机分为两组：①对照组：两只小鼠(雌雄各一)，给予生理盐水0.8ml/20g;②给药组，4只，给予最大浓度的YS(133g/100ml), 按最大体积0.8mL/20g灌胃。观察7天未发现异常。

在预试验的基础上，采用最大给药量法，给药前均禁食10小时，实验时每只小鼠给予最大生药浓度133g/100mL、最大体积0.8mL/20g体重的YS悬浮液灌胃，一次性给药，观察7天内小鼠的外观、饮食、活动、排泄、死亡等情况，7天后颈椎脱臼法处死小鼠，解剖后观察其心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等主要脏器的变化。

2.1.3结果

给药后7天内无一小鼠死亡，其皮毛光滑、饮食、活动、排泄等未出现异常，处死小鼠后经大体解剖检查，主要脏器无任何不良病变。计算出其最大耐受量为生药53.3g/kg，YS成人临床常用剂量为8g/d，经折算后[7]，给药量相当于人临床用量的333倍。

3 益舒软肝丸逆转肝硬化的初步临床研究

各种病因引起肝细胞弥漫性炎性坏死、再生、诱发肝脏广泛的纤维结缔组织增生、小叶结构破坏、假小叶形成，纤维间隔包绕再生的肝细胞而形成大、小结节，隧成为肝硬化。肝硬化分布遍及全世界，在我国也是多发病。目前西医治疗肝硬化尚无特异性疗效的方法，而中药却在治疗上表现出独特的优势，本YS为民间验方，由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、鳖甲、水蛭、桃仁等中药组成，在长期临床实践中显示益舒软肝丸治疗肝硬化作用明显，且有使部分病人肝硬化逆转的表现，收集了其中的260例加以分析，现将临床观察资料总结如下：

3.1 临床资料

260例病人均来自宜昌市怡康医院中医肝病研究所，于2000年2月-2005年1月收集，其中男172例，女88例，年龄23-75岁，平均49岁，发现肝硬化病程最短1年，最长13 年，平均7年，其中乙肝后肝硬化182例，酒精性肝硬化41例，血吸虫性肝硬化28例，胆汁淤积性肝硬化9例。合并胆囊结石40例，肝囊肿38例，脾切除术后40例，胆囊切除术后10例。诊断标准参照执行2000年9月西安全国传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的《病毒性肝炎防治方案》中的早期肝硬化诊断标准[6]。

中医辨证分为6种证型：分型标准参照1993年11月河南洛阳“中国中西医结合学会第5届消化系统疾病学术交流会”制定的中医辨证标准试行方案[10]，其中肝气郁结证128例，湿热内蕴证51例，脾虚湿盛兼血瘀证18例，血瘀证9例，脾虚湿盛证29例,脾肾阳虚证12例，湿热内蕴兼肝肾阴虚证13例。

3.2 治疗方法

YS由蛴螬、虻虫、冬虫夏草、水蛭、鳖甲、桃仁等中药组成，粉成粉末过120目筛，由宜昌县人民医院药剂科制备，未加任何辅料。成人每日2次，每次4克生药，3个月为1个疗程，一般服2-4个疗程。服药2个疗程以后进行疗效判定。

3.3 观察指标

肝功能指标：谷丙转氨酶(ALT)、血清白蛋白(A)、血清白蛋白/球蛋白(A/G)、血清胆红素(TBiL);肝脾B型超声。以上指标于治疗前后各检查1次,治疗中可根据病情随时复查。

数据经统计软件SPSS10.0用 t检验。

表1. 肝脏超声评分方法(据文献稍作修改)

益舒软肝丸逆转肝硬化的实验及初步临床研究

3.4 疗效标准

治疗结果参照1993年11月洛阳会议修订《肝硬化临床诊断、中医辨证和疗效评定标准》[10]。显效:主要症状基本消失,一般情况良好,肝脾肿大稳定不变,无叩痛及压痛,腹水消失,肝功能指标恢复正常,白蛋白恢复正常或接近正常。好转:主要症状明显好转,肝脾肿大稳定不变,无明显压痛及叩痛,腹水减少50%以上而未完全消失,肝功能指标改善幅度50%以上。无效:未达到好转标准或恶化者。

3.5 治疗结果

临床观察260例，显效163例，占62.7%，好转85例，占32.7%；无效12例，占4.6%;总有效率(显效率与好转率之和)为95.3%。260例中有130例治疗后B超示肝脾形态恢复正常，肝功能部分指标恢复正常，其中有76例治疗前肝功能异常，B超示肝脏缩小，边缘不规则，肝实质回声增粗，血管走行不清，门静脉直径>12mm，脾厚>40mm(1例脾切除);治疗3-4个疗程后肝功能指标恢复正常，B超显示肝脏大小正常，实质回声分布均匀，门静脉直径<12mm，脾厚<40mm。

3.5.1结果分析

表2 治疗前后肝功能及B超改善情况比较(X±S)

**与治疗前比较P<0.05,***与治疗前比P<0.01

3.6 典型病例

3.6.1患者黎某某，男，现年39岁 (湿热内蕴证)

自述：于1988年患有黄疸性肝炎，治疗后痊愈。2003年3月检查有慢性乙型肝炎，后一直在门诊治疗，但无明显改善，二十余天前感全身乏力，一周前出现腹胀，三日前出现双下肢水肿。遂来我处就诊。(2004.11.08)

查：双下肢水肿，皮肤淡黄，结膜淡黄，腹膨

实验室检查：ALT 1514U/L(0-50)，TB 244.3umol/L(0-28)，DB 77.5umol/L(0-8) 其余指标在正常范围内

B超示：肝大，形态尚正常，肝内回声增粗增强，血管走行尚清，PVD 13mm，胆囊壁呈双边影，脾厚4.3cm。结论：肝内回声异常。超声呈慢性肝炎改变，轻度脾肿大，门静脉、脾静脉轻度增宽。

治疗：给予YS三个疗程，在治疗过程中，进行了连续的肝功能和B超检查，结果如下：

1)2004.11.27肝功能检查结果：

ALT 200 (5-40) ，AST 172 (0-50)， A 33.5 (35-56)， G 47.4 (20-35)，A/G 0.7 (1.1-2.5)， TBIL 136 (0-20)，DBIL 81 (0-6)，IBIL 55 (2-14)

2)2005.02.01肝功能检查结果：

ALT 70 (5-40)， G 42.4 (20-35) ，A/G 0.9 (1.1-2.5)， TBIL 29 (0-20)，DBIL 14 (0-6)， IBIL 15 (2-14)

3)2005.04.08肝功能检查结果：

ALT 77 (5-40) ，AST 79 (0-50)， TP 86.1(60-85)， G 40.5 (20-35)，

4)2005.11.07肝功能检查结果：

ALT 46 (5-40)

2004.11.08 B超检查结果：

肝缩小，右叶上下径5.8cm，前后径8.9cm，肝内光点回声粗糙，不均，边界不光滑，胆囊壁厚，毛糙，脾厚5.0cm，脾门静脉1.4cm，门脉宽1.8cm，腹腔内见少量腹水回声，最厚处3.0cm。结论：肝硬化并脾中度肿大及少量腹水。

2004.12.24 B超检查结果：

肝外形略缩小，右叶上下径8.0cm，前后径10.1cm，肝内光点回声粗糙，不均，包膜较光滑。胆囊壁厚，毛糙，脾厚4.9cm，脾门静脉1.1cm，门脉宽1.7cm，脐静脉轻度开放0.2cm。腹腔内未见明显腹水回声。结论：肝硬化并脾中度肿大。

2005.04.08 B超检查结果：

肝外形略缩小，右叶上下径8.8cm，前后径12cm，肝内光点回声略增强增粗，包膜较光滑。肝血管网走行清晰，门脉宽1.4cm，胆囊壁明显增厚，毛糙，脾厚约4.8cm，脾门静脉宽1.0cm，腹腔内未见明显腹水回声。结论：肝硬化并脾中度肿大，腹腔内未见明显腹水。

2005.6.16 B超检查结果：

肝光点分布不均，光点增强、增粗，血管走行欠清，胆囊壁厚，毛糙，门脉主干内径1.2cm。结论：肝质不均

2006.03.15 B超检查结果：

肝光点分布不均，光点增粗增强，血管走行欠清，肝边光整，胆囊壁厚毛糙，门脉主干内径1.2cm 。结论：肝质不均

由上可见，肝功能在治疗近20天时ALT、TB下降，但其他有恶化提示病变仍在进行中。治疗近3个月时，ALT、TB、G、DB、IB有下降。治疗近5个月时ALT、AST、TP有少许恶化，其余有好转。治疗1年时，肝功能基本恢复正常，只有ALT有少许高，但接近正常。治疗1个月后B超提示肝脏有所增大，脾脏有少许缩小，腹水消失。治疗5个月时肝外形仍在继续恢复中，门脉高压有所减轻。治疗7个月时肝外形恢复正常，脾恢复正常，门脉高压基本好转。治疗结束时提示肝外形恢复正常，门脉虽有少许增宽，但基本恢复正常。

3.6.2患者邓某某，男，现年32岁(肝气郁结证)

自述：右下腹阵发性胀痛，饮食减退伴头晕

病史：患者于2000年上半年无明显诱因出现右季肋部胀痛，后曾检查为乙肝表面抗原阳性，B超检查肝质地欠均，多方治疗无效，后曾在我院治疗一段时间，有所好转，后未继续治疗，近来又觉右下腹不适今就诊。(2004.06.06)

查：，腹软，尿黄

实验室检查：肝功能正常

B超：肝大小形态正常范围，内部光点略粗糙不均，胆囊壁增厚毛糙，脾厚4.5cm，腹腔未见腹水回声。结论：早期肝硬化并脾大。

治疗：给予YS二个疗程，在治疗过程中，进行了连续的肝功能和B超检查，结果如下：

2005.01.08

肝功能正常

2005.01.05

肝脏大小、形态正常，内部光点分布均匀，血管网走行清晰，包膜光滑。门静脉内径宽为1.3cm，脾脏厚约3.5cm，脾门静脉内径宽6mm。结论：肝、脾未见明显异常。

由上可见，在治疗前B超仍提示肝硬化，在治疗后肝脾恢复正常。

4 讨论：

4.1 肝硬化模型的选择[2,3,4,13]

通过查阅大量文献发现，大鼠肝硬化的模型复制方法很多，最常用的有：中毒性肝损伤模型、免疫性肝损伤模型和复合性肝损伤模型：

4.1.1CCL4法

机制：CCL4入体，经肝细胞色素P450激活生成三氯甲基自由基作用于肝脏大分子，产生肝损伤。特点：1). CCL4引起中央静脉周围肝坏死，纤维增生，小叶内以窦隙为主，最后产生小结节性肝硬化。适于门脉性肝硬化，肝炎后肝硬化。有免疫反应参与。2). 病理损害形成快而重，动物死亡率高，30%-40%。模型持续时间短。3).Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达弱。4). 皮下注射CCL4橄榄油所致模型与酒精性肝损伤模型相似，但与人类乙肝病毒引起的免疫损伤发生的肝纤维化可能不完全相同。

4.1.2猪血清法

机制：可能由于Ⅲ型变态反应引起，血清的大分子物质作为异种抗原进入大鼠体内后，刺激其产生相应的抗体，当抗原再次进入大鼠体内后，抗原抗体结合，形成抗原-抗体复合物，抗原-抗体复合物可激活或结合补体。由于抗原的反复长期刺激，过量的免疫复合物来不及被清除，沉积于肝脏的血管壁内外，引起血管炎和血管周炎，造成肝损伤，形成广泛的进行性慢性炎症病变。如此反复导致肝细胞变性、坏死，肝细胞再生，纤维增生。最后发展为肝纤维化，肝硬化。特点：1). 主动性纤维间隔形成，大量胶原纤维增生，微循环障碍，亦见界板肝细胞坏死。适用于研究由抗原抗体复合物反应(如慢性乙型肝炎、慢活肝等)所致肝纤维化的机制,防治和中药筛选。可作为一种无明显肝细胞损伤性纤维化模型。2).本模型停止攻击后，自愈性低。造模方法简单，稳定，出现率高，动物整体损伤轻。3). 诱发阶段病变单纯，无明显肝细胞变性、坏死和大量炎细胞侵润，能清楚显示不同时期的间隔，有利于原位观察和分析。4).病理损害在造模结束后有逐渐加重趋势，造模结束后1-3月为主。5).模型持续时间长。6).Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及其mRNA表达强。

4.1.3 复合因素

机制：CCl4 进入体内后 15 分钟即可引起肝细胞损害至 48 小时达到高峰随后进入修复阶段给大鼠皮下注射 40% CCl4，每周2次，即在一次染毒造成肝损害之后的修复期再次染毒，重复损害-修复-损害的过程，诱导肝纤维化的形成。此外，以低蛋白饲料控制营养供给，同时摄入高脂成分以加剧机体对胆碱的需要量，加重肝细胞变性，饮用乙醇也能增加机体对胆碱的需要量，还可作为一种酶诱导剂，增强 CCl4 的毒性。特点：1). 形成率高，死亡率低20%。2).病变分期明显，1-2周为肝细胞变性坏死期，3-4周为肝纤维化期，5-6周为肝硬化期。

综合各种方法的优缺点，考虑到复合性肝损伤模型形成肝硬化时间短，形成率高，所需药品易获得，益舒软肝丸通过临床应用发现可用于各种原因导致的肝硬化，因此对本实验采用了复合性肝损伤模型。

4.2 益舒软肝丸逆转肝硬化作用机制分析

目前认为肝硬化是以病毒性肝炎、血吸虫病或化学毒性物质(酒精、药物等)等因素引起肝脏损伤为起点，启动级联反应，激活肝脏内库普弗细胞(KC)连同局部浸润的单核细胞、淋巴细胞、血小板等而释放各种炎症介质和细胞因子，如转化生长因子(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、IL-1、IL-6和TNF等。释放的细胞因子进一步激活静息状态的肝星状细胞(HSC)，使之转化为肌成纤维细胞。肌成纤维细胞过度增殖，同时大量合成胶原等细胞外基质(ECM)。正常肝脏中存在着ECM产生和分解的动态平衡，由于多种致病因子的长期作用而打破了肝脏内ECM的这种动态平衡，导致ECM合成增加，降解减少，从而造成ECM的过度沉积，最终导致肝纤维化，严重者进一步形成肝硬化[14]。

ECM包括胶原、非胶原糖蛋白、蛋白多糖及弹性硬蛋白等成分。ECM不仅为肝组织提供机械性支架作用，而且对于细胞的增殖、分化、迁移和基因表达调控也是不可缺少的。HSC是产生ECM的主要细胞，但肝脏中其它细胞也产生ECM。慢性活动性肝纤维化时，ECM成分与细胞相互作用，促进肝细胞损害及HSC的活化，并引起间质细胞移动，此时基质的合成和降解均活跃，但基质和胞外网架改变已使ECM对降解的敏感性降低;后期则是降解明显减少起主要作用，ECM质和量的改变反过来又可激活静息状态的HSC，进一步加重ECM沉积，形成恶性循环，最后导致肝纤维化和肝硬化的发生[15]。

4.2.1抗脂质过氧化，减轻肝细胞损伤

HSC激活是肝纤维化肝硬化发生发展的中心环节，自由基及其引发的脂质过氧化是HSC活化和增殖的重要媒介。SOD能催化氧自由基歧化反应，清除自由基，使细胞免受损伤;MDA是脂质过氧化的终产物之一，被视为自由基产生的间接指标。本实验联合检测SOD和MDA含量，能间接反映机体过氧化反应对组织的损伤程度。实验结果发现YS高、中、低组SOD较生理盐水组有一定升高，MDA含量则明显降低，表明YS有降低自由基生成，减轻脂质过氧化的作用。其保护肝细胞，减轻肝损伤，改善肝功能可能是抗脂质过氧化的结果。

4.2.2抑制肝组织TGF-β1的表达

TGF-β(主要是TGF-β1)是迄今为止被认为最强的致纤维化因子，其作用机制有[16]： ①能刺激肝脏成纤维细胞合成胶原;②能抑制HSC胶原酶表达及促进TIMP的产生，减少ECM的降解，结果ECM净生成增加;③可刺激HSC合成PDGF，并增加PDGF受体的表达，从而促进HSC的增殖。本实验结果显示，用药组肝组织TGF-β1的阳性总面积减少，平均灰度值增加。提示YS可能通过抑制TGF-β1的表达，使HSC的增殖活化得到抑制，减少胶原合成，增加ECM的降解，从而逆转肝硬化。

4.2.3抑制TIMP-1表达，促进ECM降解

ECM合成和降解的主要调控因子是基质金属蛋白酶(MMPs)和组织基质金属蛋白酶抑制因子(TIMPs)。基质金属蛋白酶类(MMPs)是一组锌钙依赖性内肽酶，它通过降低胶原螺旋结构的稳定性，改变底物的二级结构，为其他蛋白酶作进一步降解创造条件。其功能主要是降解诸如胶原、蛋白聚糖等细胞外基质成分，在正常胚胎发育、器官发生、血管形成、创伤愈合过程以及关节炎、骨质疏松、组织纤维化等多种疾病过程中起着重要作用。TIMPs是一组具有抑制MMPs功能的活性多肽，它不但与MMP酶原以1：1形式相结合抑制其活化，而且能灭活活性酶，从而使MMPs失去降解功能，抑制ECM的降解[17,18]。

肝纤维化时TIMP-1大量表达，使MMPs活性减少，造成肝损伤后增生的ECM成分尤其是Ⅰ、Ⅲ型胶原降解减少，沉积增多，而通过抑制TIMP-1的表达，可有效抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的增生，从而延缓纤维化的发展。本实验结果显示用药组肝组织TIMP-1的阳性总面积减少，平均灰度值增加。提示YS可能通过抑制TIMP-1表达是促进ECM降解，拮抗肝硬化。

实验研究发现益舒软肝丸中剂量整体效果优于小剂量，说明抗肝硬化效应与用药剂量相关。但中剂量与大剂量作用无明显差异，表明了中药量效关系的复杂性，因此尚需进一步、深入的研究。

4.3 益舒软肝丸的毒理实验

为了判定YS对人体是否产生积累毒性，保证临床用药安全，我们对YS进行了急性和长期毒理实验研究。

在小鼠急性毒理实验中，我们给予了最大浓度和最大容积的YS混悬液灌胃。在观察期间，无一小鼠死亡，各小鼠皮毛光滑，饮食、活动、排泄等未见异常。处死小鼠后，各主要内脏肉眼无不良病变。计算其最大耐受量为53.3/kg，相当于人临床日用量的333倍，说明该药无明显毒性。

4.4 益舒软肝丸的初步临床研究

通过临床观察发现，YS治疗肝硬化疗效确切，有以下作用:①改善症状体征。用药一个疗程后，病人食欲、体力基本恢复，腹水、鼻出血、下肢水肿、上腹痛普遍好转。②恢复肝脏功能。ALT反映肝细胞变性坏死程度;TBIL升高是胆汁郁积的表现;白蛋白主要由肝脏合成，其血清水平反映肝细胞合成功能(有效肝细胞总数);白球比(A/G)反映了肝细胞的功能。血清肝功能指标检测得出,ALT、TBIL均较治疗前明显下降(P<0.05),A、A/G比值升高,治疗前后对比均具有显著性差异(P<0.01)。③改善影像学表现。YS可明显改善肝脾B超表现, 260例中有163例治疗前B超示肝缩小，边缘呈锯齿状，实质回声增粗，血管走行不清，脾大，治疗后B超示肝脾大小恢复正常，占62.7%。B超总评分较治疗前有显著性改善(P<0.01)。④逆转肝硬化。260例患者中76例治疗后肝功能恢复正常，肝脏大小恢复正常，肝实质回声分布均匀，门静脉直径<12mm，脾厚<40mm。综合血清学及影像学改善情况可以看出, YS具有良好的治疗肝硬化作用，临床疗效高，有效率达95.4%，未见明显毒副作用。尤其是其可使76例治疗前肝功能指标异常、肝脾形态及大小异常、门静脉增粗的病例治疗后肝功能指标和肝脾大小及回声完全恢复正常，有使肝硬化逆转的表现，对目前肝硬化治疗无法达到逆转而言是一个突破。

4.5 益舒软肝丸的中医理论基础

肝硬化为现代医学病理名词，中医学未对其理论治法进行具体论述，根据其形成的病理过程特点及临床表现，多将其归属于中医的癥瘕、积聚、臌胀等范畴。

由于慢性肝炎、血吸虫病等肝病失治、误治或治疗不彻底，湿热毒邪未清除,肝失疏泄、脾失运化、水湿内停蓄积于腹中,肝郁气滞、气滞则血瘀,瘀阻脉络日久则成积聚。另一方面，湿邪易伤阳耗气,热邪灼阴血耗津液，湿热久蕴则伤阴血耗阳气，日久导致肝脾肾亏虚，气血两虚,气虚则血瘀，气血运行不畅则津液不能输布,水湿蓄于腹中成臌胀。或者饮食不节、嗜酒过度,或情志内伤、劳欲过度，导致肝、脾、肾功能受损,气滞、血瘀、水湿内停而成臌胀。中医认为肝硬化的基本病机是正衰邪盛，湿热未尽兼血瘀，肝郁脾肾气血虚。肝郁气滞，导致血瘀，经隧阻塞，血不养肝，关键在于血瘀。血瘀表现在肝硬化的病理上就是肝纤维化的形成。

因此，益舒软肝丸以活血化瘀，补气养血，健脾补肾为治疗原则。方中水蛭、虻虫、蛴螬可破血逐瘀、通经软坚;配鳖甲、桃仁，可化瘀通经，去瘀生新;加冬虫夏草补肺肾、益精气。现代药理研究已证实，以上诸药具有程度不等的抗肝纤维化作用。

4.5.1药物分析

蛴螬：咸、苦，温。有毒。入肝经。能行血化瘀，解毒通闭。《本经》：“蛴螬、味咸、微温。主恶血瘀、御览作血痹痹气破折、血在肋下坚满痛，目闭、目中淫肤，青翳白膜。”《长沙药解》：“蛴螬，能化淤血……”。

虻虫：苦，凉，有毒。入肝经。有逐瘀通经，破积软坚的功效。《神农本草经》“主逐淤血，破血积，坚块，……”。《本草纲目》：“成无已云，苦走血，血结不行者，以苦攻之，故治蓄血用虻虫，乃肝经血分药也。古方多用，今人稀使。”

水蛭：咸、苦，平。有小毒。入肝经。主要功效为破血逐瘀。《神农本草经》载：水蛭“治恶血、瘀血、月闭、破血癥积聚、无子、利水道。”常用于治疗蓄血、经闭、跌打损伤等证。

冬虫夏草：甘，温。入肾、肺二经。主要功能是补肺肾、益精气。有实验证明，冬虫夏草能抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏内的沉积，并使已形成的胶原重新溶解和吸收等防治肝纤维化作用。

桃仁：味苦，性平，无毒。主要功能是破血行瘀。《本草纲目》载有桃仁治瘀血、血闭癥瘕邪气。桃仁能提高肝血流量，增强肝组织基质金属蛋白酶的活性，促进肝内胶原分解代谢及降低肝组织胶原含量等功效，其抗肝纤维化作用广泛。

鳖甲：味咸，性微寒，善走肝经血分，消痞化癥，软坚散结。《雷公炮炙论》：“治气、破块、消癥、定心药中用之。”已有实验证明鳖甲对早期或晚期肝硬化大鼠均有促进肝细胞恢复及纤维组织重吸收作用。

5 结论

⑴ 实验结果显示YS有很好的逆转肝硬化作用，其作用机制包括：①抗脂质过氧化，保护肝细胞，减轻肝细胞损伤;②抑制TGF-β1的表达,减少胶原合成,增加ECM的降解;③抑制TIMP-1表达，促进ECM降解。

⑵ YS的毒理实验表明，该药拟用的日剂量及疗程在临床应用上是安全的。

⑶ 临床研究也证实YS有较好的治疗肝硬化，逆转肝硬化的表现。